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Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la Papa

Objetivos:

  • Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente en extractos de papa.
  • Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.
  • Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la actividad de la fenoloxidasa de la pasa.
Marco Teórico:

          Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas. Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan endefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

         La característica más sobresaliente de las enzimas en su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: Especificidad de sustrato; el sustrato es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica. Especificidad de acción; cada reacción está catalizada por una enzima específica.

         La acción enzimática se caracteríza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.


Materiales y Reactivos:

Materiales

  • Baño Termométrico: Termómetro para las medidas de las termorresistencias. Sistema modular para las medidas de termopares.
  • Tubos de Ensayo: Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas, realizar reacciones en pequeña escala, entre otras cosas.
  • Gradilla: es utilizada para sostener y almacenar gran cantidad de tubos de ensayo, de todos los diámetros y formas.
  • Bureta:Las buretas son tubos cortos, graduados, de diámetro interno uniforme, provistas de un grifo de cierre o llave de paso en su parte inferior. Se usan para ver cantidades variables de líquidos, y por ello están graduadas con pequeñas subdivisiones (dependiendo del volumen, de décimas de mililitro o menos). Su uso principal se da en volumetrías, debido a la necesidad de medir con precisión volúmenes de líquido variables.
  • Vaso químico: Material de laboratorio de vidrio, que se utiliza como recipiente y también para obtener precipitados.
  • Gotero: es un tubo hueco terminado en su parte inferior en forma cónica y cerrado por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Se utiliza para trasvasar pequeñas cantidades de líquido vertiéndolo gota a gota.
  • Pipetas: La pipeta es un instrumento volumétrico de laboratorio que permite medir la alícuota de líquido con bastante precisión. Suelen ser de vidrio. Está formada por un tubo transparente que termina en una de sus puntas de forma cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas) indicando distintos volúmenes.
  • Erlenmeyer: El matraz o frasco de Erlenmeyer es un frasco transparente de forma cónica con una abertura en el extremo angosto, generalmente prolongado con un cuello cilíndrico, que suele incluir algunas marcas. Por su forma es útil para realizar mezclas por agitación y para la evaporación controlada de líquidos; además, su abertura estrecha permite la utilización de tapones.
  • Gaza: Una gasa es una malla, con más o menos hilos (lo cual determina la calidad del resultado final del impreso). Existen mallas para este proceso de muchos tipos y diferentes hilos usados. La gasa de algodón ha sido tradicionalmente usada en compresas y vendas para cubrir y proteger heridas sin impedir el contacto con el aire.
  •  
  • Embudo Buchner: Un embudo Büchner es una pieza del material de laboratorio de química utilizado para realizar filtraciones. Tradicionalmente se produce en porcelana, por lo que se lo clasifica entre el material de porcelana. Pero también hay disponibles en vidrio y plástico, a causa de su bajo costo y menor fragilidad, utilizados principalmente en escuelas secundarias.
  • Licuadora: un electrodoméstico con un motor eléctrico que hace girar unas cuchillas que muelen los alimentos.
  • Espectrofotómetro Visible: Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
Reactivos

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Procedimiento:





SOLUCIONES/TUBO
1
2
3
4
5
6
Estudio de la actividad enzimática sin inhibidor
mL Amortiguador pH 6
4
4
4
4
4
4
mL Agua destilada
9
7
5
3
1
11
mL de Pirogalol 1%
2
4
6
8
10
-
Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm.  Proceder con un tubo a la vez y añadir la enzima.
mL Enzima
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Estudio de inhibición con ác. Benzoico 0.02%
mL Amortiguador pH 6
4
4
4
4
4

mL Agua destilada
8
6
4
2
0

ml de Pirogalol 1%
2
4
6
8
10

ml de ác. Benzoico 0.02%
1
1
1
1
1

Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm. Proceder con un tubo a la vez y añadir 2ml de enzima
Actividades:

1. Construya un gráfico de actividad (Unidades de Absorbancia por segundo) versus Concentración de Pirogalol.
2. Graficar también 1/act.Vs 1[S] y calcular la Km de la fenolasa.
3. Construya un gráfico de actividad (Unidades de Absorbancia por segundo) versus Concentración de Pirogalol. Con inhibidor.
4. Graficar también 1/act. Vs [S] y calcular la Km aparente, el tipo de inhibición y la K del ácido benzoico.


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