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Pruebas Cualitativas para Aminoácidos y Proteínas

Resumen


Por la estructura peptídica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las proteínas pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinación cuantitativa y cualitativa de las proteínas. Por presentarse variaciones en la composición de los aminoácidos de las diferentes proteínas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reacción, íntimamente relacionado con la naturaleza de la proteína analizada.

Objetivos

· Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y proteínas.
· Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con agentes físicos y químicos.
Marco Teórico
La Ninhidrina
La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos.
Reacciona con todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido
Esta prueba es positiva tanto para proteínas como para aminoácidos. en aquellos casos donde no da positiva la prueba de biuret y da positiva la de ninhidrina, indica que no hay proteinas, pero si hay aminoacidos libres.
La Reacción Xantoproteica
Los aminoácidos, que contienen un núcleo aromático forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali, se torna color amarillo oscuro. La fenilalanina, la tirosina y en cierto grado el Triptófano, así como todas las proteínas que los contienen, dan positiva la prueba.
Según las guías químicas es una reacción cualitativa, más no cuantitativa. Por ende determina la presencia o no de proteínas. Para cuantificar se usa otra reacción, como la de Biuret, y se hace un análisis espectro fotométrico.
Reacción para el triptófano [
Este aminoácido se condensa fácilmente con varios aldehídos en presencia de ácidos fuertes para dar compuestos coloreados. En la reacción se utiliza el reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 10% en HCL concentrado.) que reacciona con un buen número de compuestos orgánicos tales como índoles, aminas aromáticas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados.
Reacciones para cisteína y cistina
Cuando los aminoácidos y las proteínas que contienen grupos tiólicos se calientan en medio fuertemente alcalino, el azufre presente reacciona para formar sulfuros. Este sulfuro puede detectarse por la formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adición de acetato de plomo. Los grupos tioles también reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia de un exceso de amoníaco para dar un complejo de color rojo.
Prueba para Arginina
El aminoácido Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral, este grupo reacciona con el reactivo de Sakaguchi (a-naftol/agua de Bromo) en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.
Prueba de Biureth
es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
Desnaturalización por calor y pH extremos
Una pérdida de la estructura tridimensional suficiente para causar pérdida de la función se llama desnaturalización. Se forma un conjunto de cadenas polipeptídicas con distinto grado de plegamiento. La desnaturalización no significa que siempre se obtenga la cadena polipéptidica totalmente desplegada. Los productos de desnaturalización en solución se agregan físicamente y según las condiciones de pH y fuerza iónica, precipitan.
El objetivo de elegir un paso de purificación desnaturalizante es crear las condiciones donde la proteína de interés no se desnaturalice mientras que los otros componentes se desnaturalicen y precipiten.
Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas
Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separación de proteínas y en la preparación de filtrados libres de proteínas. A pH neutro por lo general las proteínas tienen carga neta negativa y se combinan fácilmente con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitación. A pH por debajo del punto isoeléctrico en cambio, se combinan con aniones porque presentan carga neta positiva. Soluciones concentradas de sales, de sulfato de amonio.
Materiales y Reactivos
Materiales:
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Tubos de Ensayo: Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas, realizar reacciones en pequeña escala, entre otras cosas.
Gradilla: es utilizada para sostener y almacenar gran cantidad de tubos de ensayo, de todos los diámetros y formas.
Gotero: Consiste en un pequeño tubo de vidrio y en uno de sus extremos tiene un capuchón de hule, que permite succionar o añadir soluciones.

Baño María: es un método empleado en las industrias, en laboratorio de química y en la cocina, para conferir temperatura uniforme a una sustancia líquida o sólida o para calentarla lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor con agua que se lleva a o está en ebullición.


Reactivos
HCl: Es muy corrosivo y ácido. Se emplea comúnmente como reactivo químico y se trata de un ácido fuerte que se disocia completamente en disolución acuosa. A temperatura ambiente, el cloruro de hidrógenoes un gas ligeramente amarillo, corrosivo, no inflamable, más pesado que el aire, de olor fuertemente irritante. Cuando se expone al aire, el cloruro de hidrógeno forma vapores corrosivos densos de color blanco. El cloruro de hidrógeno puede ser liberado por volcanes. Por ingestión puede producir gastritis, quemaduras, gastritis hemorrágica, edema, necrosis. Se recomienda beber agua o leche y NO inducir el vómito. Por inhalación Puede producir irritación, edema y corrosión del tracto respiratorio, bronquitis crónica. Se recomienda llevar a la persona a un lugar con aire fresco, mantenerla caliente y quieta. Si se detiene la respiración practicar reanimación cardio pulmonar. Al contacto con la piel Puede producir quemaduras, úlceras, irritación. Retirar de la zona afectada toda la vestimenta y calzados y lavar con agua abundante durante al menos 20 minutos. Y al contacto con la piel puede producir necrosis en la córnea, inflamación en el ojo, irritación ocular y nasal, úlcera nasal. Lavar el o los ojos expuestos con abundante agua durante al menos 15 minutos.
Tirosina: es uno de los 20 aminoácidos que forman las proteínas. Se clasifica como un aminoácido no esencial en los mamíferos ya que su síntesis se produce a partir de la hidroxilación de otro aminoácido: la fenilalanina, es un sólido que forma cristales y que generalmente presenta un color blanquecino, aunque también puede ser incoloro. Se considera un aminoácido polar y protonable. Aunque normalmente se clasifica como aminoácido hidrofóbico a causa de su anillo aromático. Hay que tener en cuenta que también contiene un grupo hidroxilo. Normalmente se encuentra sin carga, aunque a pH muy básico presenta carga negativa.Por lo que respecta a su solubilidad sabemos que es soluble en agua y ligeramente soluble en alcohol. También conocemos su insolubilidad en éter.
Triptófano: es un aminoácido esencial en la nutrición humana. Es uno de los 20 aminoácidos incluidos en el código genético. Se clasifica entre los aminoácidos apolares, también llamados hidrófobos. Es esencial para promover la liberación del neurotransmisor serotonina, involucrado en la regulación del sueño y el placer. Su punto isoeléctrico se ubica a pH=5.89. La ansiedad, el insomnio y el estrés se benefician de un mejor equilibrio gracias al triptófano.
Cisteína: es un α-aminoácido con la fórmula química HO2CCH(NH2)CH2SH. Se trata de un aminoácido no esencial, lo que significa que puede ser sintetizado por los humanos. Los codones que codifican a la cisteína son UGU y UGC. La parte de la cadena donde se encuentra la cisteína es el tiol que es no polar y por esto la cisteína se clasifica normalmente como un aminoácido hidrofóbico.
Cistina: La cistina es un dímero de dos cisteínas a través de un puente disulfuro. Tiene un punto de ebullición entre 247 y 249 °C.
Prolina: es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. La prolina está involucrada en la producción del colágeno. Está también relacionada con la reparación y mantenimiento de los músculos y huesos. Se trata del único aminoácido proteinogénico cuya α-amina es una amina secundaria en lugar de una amina primaria. Aunque no posee un grupo imino, en ocasiones es referida erróneamente como un iminoácido. Se forma directamente a partir de la cadena pentacarbonada del ácido glutámico, y por tanto no es un aminoácido esencial.
Hidroxiprolina: es un aminoácido no esencial constituyente de proteínas y derivado de la prolina. Para esta hidroxilación, existe una proteína llamada prolinhidroxilasa, que reconoce a la prolina como su sustrato.
Arginina: es uno de los 20 aminoácidos que se encuentran formando parte de las proteínas. En el tejido hepático, la arginina puede ser sintetizada en el ciclo de la ornitina (o ciclo de la urea). Se clasifica, en población pediátrica, como un aminoácido esencial. Este aminoácido se encuentra involucrado en muchas de las actividades de las glándulas endocrinas
Fenilalanina: es un aminoácido. Se encuentra en las proteínas como L-fenilalanina (LFA), siendo uno de los diez aminoácidos esenciales para humanos. La fenilalanina es parte también de muchos psicoactivos. Posee un pK de 8.5, un pH de 8 Tiene un peso molecular de 69.000, un pI de 4,9.
Caseína: es una fosfoproteína (un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno. Precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche.
Gelatina: es una mezcla coloide (sustancia semisólida), incolora, translúcida, quebradiza y casi insípida que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con agua. También existe una gelatina vegetal conocida como agar-agar.
La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímerocompuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómerosy la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: se derrite con el agua caliente y se solidifica nuevamente y se hincha con el agua fría.
Reactivo de Biureth: es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.
Ácido Nítrico concentrado, HNO3: es un liquido incoloro que se descompone lentamente por la acción de la luz, adoptando una coloración amarilla por el NO2 que se produce en la reacción. En el aire húmedo despide humos blancos, su punto de fusión es de -43ºC y su punto de ebullición es de 83 ºC pero a esa temperatura se acentúa su descomposición. Es soluble en agua en cualquier proporción y cantidad y su densidad es de 1,5 g/ml.
Hidróxido de Sodio, NaOH: el hidróxido de sodio es un sólido blanco cristalino sin olor que absorbe humedad del aire (higroscópico). Es una sustancia manufacturada. Cuando se disuelve en agua o se neutraliza con un ácido libera una gran cantidad de calor que puede ser suficiente como para encender materiales combustibles. El hidróxido de sodio es muy corrosivo. Generalmente se usa en forma sólida o como una solución de 50%.
Ácido Acético Glacial: Inflamable. Provoca quemaduras graves.
Acetato de Plomo II: es un compuesto químico cristalino de color blanco con un sabor ligeramente dulce. Se obtiene tratando litargirio (óxido de plomo (II) ó PbO) con ácido acético. Al igual que otros compuestos plúmbeos, es una sustancia muy tóxica. El acetato de plomo es soluble en agua y glicerina. Con agua, forma el trihidrato, Pb(CH3COO)2·3H2O, una sustancia cristalina monoclínica eflorescente de color blanco o incoloro.
Ácido Pícrico: sólido, cristales amarillos, inflamable, de fórmula química C6H2OH(NO2)3, es un explosivo que se utiliza como carga aumentadora para hacer explotar algún otro explosivo menos sensible como el TNT.
Ácido Tricloroacético: Sustancia cáustica y corrosiva, hemostática eficaz, que aplicadas sobre la piel, mucosas o tejidos patológicos- heridas, ulceraciones, provocan destrucción de la células por acción química originando una masa o tejido muerto, alrededor actúa como irritante, dando lugar a una zona inflamada ocasionada por el medicamento. Se puede emplear para destruir lesiones intraepiteliales, cervicales, uterinas o displasias cervicales.

Procedimiento
a. Reacción de la ninhidrina

b. Reacción xantoproteica

c. Prueba del ácido glioxílico

d. Prueba de Ehrlich para triptófano

e. Reacciones para cisteína y cistina
f. Reacción para la arginina
g. Ensayo de Biureth para proteínas:
h. Desnaturalización por calor y pH extremos


Actividades

·         Confeccione un cuadro de resultados para cada prueba e ilustre los colores obtenidos en los resultados positivos o negativos de las pruebas.  Anote comentarios y posibles explicaciones en los resultados negativos.
·         Describa la reacción de la ninhidrina con ácido aspártico, lisina y glutamina.
·         Se tienen cuatro frascos sin rotular, que se sabe contienen soluciones de los siguientes aminoácidos: glicina, arginina y tirosina y otro con el tripéptido Gli-Arg-Gli.  ¿Cómo los identificaría?
·         Enumere cuatro agentes físicos y cuatro agentes químicos que pueden desnaturalizar las proteínas.
·         Investigue cómo afecta la fuerza iónica del medio la solubilidad de las proteínas.

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