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Deshidrogenasa Succínica del Hígado

Objetivos:

  • Detectar la actividad enzimática de la deshidrogenasa succínica del hígado utilizando indicadores redox como aceptores artificiales de electrones.

  • Establecer qué sustancias pueden actuar como inhibidores de la deshidrogenasa succínica.


Marco Teórico:

La deshidrogenasa succínica es una enzima especial de la mitocondria, porque participa en dos procesos metabólicos  a la vez, el ciclo de Krebs y la cadena de transporte electrónico. En el ciclo de Krebs, la enzima convierte en fumarato en presencia de FAD como coenzima.

El 2,6-diclorofenolindofenol y el azul de metileno resultan ser indicadores redox apropiados para funcionar en los homogenizados de tejidos.

Se trata de sustancias de color azul en su forma oxidada, que al aparecer átomos de hidrógenos del sustrato originan la forma leuco, la cual es incolora. Con este cambio del indicador redox se comprueba que la enzima está transformando el sustrato.

Materiales y Reactivos:

Materiales

  • Tubos de Ensayo: Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas, realizar reacciones en pequeña escala, entre otras cosas.
     
  • Gotero: es un tubo hueco terminado en su parte inferior en forma cónica y cerrado por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Se utiliza para trasvasar pequeñas cantidades de líquido vertiéndolo gota a gota.
  • Probeta: Este material permite medir volúmenes de líquidos, las hay de vidrio, plástico y de diferentes capacidades.
  • Gradilla: es utilizada para sostener y almacenar gran cantidad de tubos de ensayo, de todos los diámetros y formas.
  • Licuadora: un electrodoméstico con un motor eléctrico que hace girar unas cuchillas que muelen los alimentos.
  • Cuchillo: Sirve para cortar materiales u objetos.
  • Vaso Químico: Material de laboratorio de vidrio, que se utiliza como recipiente y también para obtener precipitados.
     
  • Balanza: es un tipo de balanza utilizada para determinar o pesar la masa de objetos.
     
  • Plancha de Calentamiento: esta diseñado para calentar muestras a temperaturas hasta 350º ideal para suplir las necesidades de calentamiento.
     

Reactivos:
  • Solución amortiguadora de fosfato monobásico de sodio 0.1 M de pH = 7.4: Irritación y enrojecimiento de la piel por un contacto prolongado. Irritación y ardor en los ojos.


  • Solución de 2,6 diclorofenolindofenol al 0.02 % en agua:Sustancia no peligrosa.


  • Solución de azul de metileno al 0.02 % acuoso: Nocivo en caso de ingestión.


  • Solución de malonato de sodio 0.1 M: No se descartan otras características peligrosas. Observar las precauciones habituales en el manejo de productos químicos.


  • Solución de succinato de sodio 0.2 M: Tóxico y Reactivo. Irritante y Combustible.


  • Solución de cianuro de sodio 0.1 M: El polvo o neblina (solución)puede ser irritante a las vías respiratorias y garganta. En NaCN reacciona con la humedad liberando gas cianhídrico.El cianuro en forma de polvo o como gas de cianhídrico, es rápidamente absorbido por los ojos y puede ser las vía de severas irritaciones e intoxicación. Debido al contenido de hidróxido de sodio puede causar daños a los tejidos severos y dolorosos.
    Es un tóxico por absorción de la piel. El contacto prolongado o repetido puede causar escozor, caracterizado por erupciones musculares, papilares y vesiculares. A través de la piel se puede absorber cantidades fatales de cianuro de sodio El cianuro inhibe la oxidación tisular provocando la muerte por asfixia química en minutos.
    No figura como cancerígeno.
  • Acetona: Es irritante y corrosiva, peligrosa en grandes concentraciones y sus gases son tóxicos y combustible.


  • Hígado fresco
    Procedimiento:




    Rect
    Solución
    Tubos


    1
    2
    3
    4
    5
    6
    A
    ml de amortiguador
    0.5
    0.5
    0.5
    0.5
    0.5
    0.5
    B
    ml de sustrato
    0.0
    0.5
    0.5
    0.5
    0.5
    0.5
    C
    Ml de agua destilada
    1.0
    0.5
    0.5
    0.0
    0.0
    0.0
    D
    Ml de homogenizado
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    E
    Ml de indicador DICPIP O Azul de metileno
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    F
    Ml de malonato de sodio
    -
    -
    -
    0.5
    -
    -
    G
    Ml de azida de sodio
    -
    -
    -
    -
    0.5
    -
    H
    Ml de cianuro de sodio
    -
    -
    -
    -
    -
    0.5






    Determinación Cualitativa de los Carbohidratos

    Objetivos:

    • Realizar pruebas cualitativas para detectar carbohidratos con base en la formación furfural.
    • Ensayar la prueba para azúcares reductores.
    • Realizar pruebas cualotativas para polisacáridos.

    Marco Teórico:

          Los carbohidratos son compuestos orgánicos, formados primordialmente por carbono, hidrógeno y oxígeno. Se encuentra en muchos productos naturales y son una de las fuentes principales de energía para los organismos quimiotróficos.

          La unidad fundamental de los carbohidratos son los monosacáridos, éstos son polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas.

          Los monosacáridos se combinan, con la pérdida de las moléculas de agua uniéndose mediante enlaces glicosídicos, formándose oligosacáridos y polisacáridos.

          En presencia de ácidos no oxidantes, los carbohidratos se deshidratan y forman furfural si el monosacárido es una pentosa o hidroximetilfurfural, si el monosacárido es una hexosa.

          Cuando la reacción de la deshidratación se efectúa con la ayuda del ácido sulfúrico concentrado y el color se desarrolla en alfa-naftol, la prueba se denomina reacción de Molisch.

    Materiales y Reactivos:

    • Tubos de Ensayo: Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas, realizar reacciones en pequeña escala, entre otras cosas.

    • Gradilla: es utilizada para sostener y almacenar gran cantidad de tubos de ensayo, de todos los diámetros y formas.
    • Gotero: es un tubo hueco terminado en su parte inferior en forma cónica y cerrado por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Se utiliza para trasvasar pequeñas cantidades de líquido vertiéndolo gota a gota.
    • Probeta: Este material permite medir volúmenes de líquidos, las hay de vidrio, plástico y de diferentes capacidades.
    • Vaso Químico: Material de laboratorio de vidrio, que se utiliza como recipiente y también para obtener precipitados.
    • Plancha de Calentamiento: esta diseñado para calentar muestras a temperaturas hasta 350º ideal para suplir las necesidades de calentamiento.
    Reactivos:

    • Glucosa al 1%: La solución de GLUCOSA AL 5% está indicada cuando es necesario administrar agua libre de sodio; es auxiliar en el mantenimiento o corrección del equilibrio hidroelectrolítico. Cuando se desea incrementar el aporte calórico y en los casos en que se requiere mantener una vena permeable. Las soluciones de glucosa al 10%-50% son consideradas soluciones hipertónicas, están indicadas en el tratamiento del colapso circulatorio y de los edemas cerebrales y pulmonares. Está contraindicada en la diabetes mellitus y en el coma de la misma. Se debe restringir su empleo en pacientes con edema con o sin hiponatremia; en la insuficiencia cardiaca con edema pulmonar o sin éste y en ­pacientes oligo-anúricos. En el coma hiperosmolar y en la hiperglucemia. Las contraindicaciones principales serían el coma addisoniano y la diabetes.
    • Fructosa:  A pesar de la buena imagen de este carbohidrato natural, el consumo de productos edulcorados con fructosa (mermeladas, productos integrales,..) puede resultar muy engordante, no sólo por su contenido en calorías sino también porque es metabolizada de una forma diferente a otros carbohidratos, favoreciendo en gran medida la acumulación de grasa.
    • Lactosa: La lactosa es un disacárido formado por la unión de una molécula de glucosa y otra de galactosa. Concretamente intervienen una β-galactopiranosa y una β-glucopiranosa unidas por los carbonos 1 y 4 respectivamente. Al formarse el enlace entre los dos monosacáridos se desprende una molécula de agua. Además, este compuesto posee el hidroxilo hemiacetálico, por lo que da la reacción de Benedict, es decir es reductor.
    • Almidón: El almidón es un polisacárido de reserva alimenticia predominante en las plantas, constituido por amilosa y amilopectina. Proporciona el 70-80% de las calorías consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidón como los productos de la hidrólisis del almidón constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestibles de la dieta habitual.
    • Reactivo de Benedict: Nocivo para los organismos acuáticos, en contacto con ácidos libera gases tóxicos.
    • Lugol: El lugol o solución de Lugol es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua destilada. Fue preparada por primera vez en 1829 y nombrada en honor al médico francés J.G.A. Lugol.Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para la desinfección de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en análisis médicos y de laboratorio.
    • Alfa-Naftol: Nocivo en contacto con la piel y por ingestión. Irrita las vías respiratorias y la piel. Riesgo de lesiones oculares graves.
    • Etanol: un líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78 °C. El etanol puede afectar al sistema nervioso central, provocando estados de euforia, desinhibición, mareos, somnolencia, confusión, ilusiones.
    • Ácido Sulfúrico Concentrado: Es extremadamente corrosivo a todos los tejidos del cuerpo, causando rápida destrucción de los tejidos y serias quemaduras químicas en contacto con la piel u ojos. El contacto con la piel u ojos requiere inmediata atención de primeros auxilios. La inhalación de neblina o humos de ácido sulfúrico puede producir irritación de la nariz, garganta.
    • Reactivo de Bial: El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico, el cual forma complejos de coloración sólo con las pentosas.
    • Reactivo de Sliwanoff: El reactivo consiste en resorcinol y ácido clorhídrico concentrado. La hidrólisis acida de polisacáridos y oligosacáridos da azucares simples. Entonces la cetosa deshidratada reacciona con el resorcinol para producir un color rojo. Es posible que las aldosas reaccionen produciendo un leve color rosa.
      La fructosa y la sacarosa son dos azucares comunes que dan positiva a esta prueba. Sacarosa da positivo al ser un disacárido compuesto por fructosa y glucosa.
    • Reactivo de Barfoed: Este reactivo contiene Cu2+ en un medio ligeramente ácido y es una prueba característica de monosacáridos.
    Procedimiento:
    1. Pruebas basadas en la formación de furfurales:




    2. Pruebas para azúcares reductores:






        3. Prueba del yodo:
       

      Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la Papa

      Objetivos:

      • Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente en extractos de papa.
      • Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.
      • Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la actividad de la fenoloxidasa de la pasa.
      Marco Teórico:

                Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas. Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan endefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

               La característica más sobresaliente de las enzimas en su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: Especificidad de sustrato; el sustrato es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica. Especificidad de acción; cada reacción está catalizada por una enzima específica.

               La acción enzimática se caracteríza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.


      Materiales y Reactivos:

      Materiales

      • Baño Termométrico: Termómetro para las medidas de las termorresistencias. Sistema modular para las medidas de termopares.
      • Tubos de Ensayo: Consiste en un pequeño tubo de vidrio con una punta abierta (que puede poseer una tapa) y la otra cerrada y redondeada, que se utiliza en los laboratorios para contener pequeñas muestras líquidas, realizar reacciones en pequeña escala, entre otras cosas.
      • Gradilla: es utilizada para sostener y almacenar gran cantidad de tubos de ensayo, de todos los diámetros y formas.
      • Bureta:Las buretas son tubos cortos, graduados, de diámetro interno uniforme, provistas de un grifo de cierre o llave de paso en su parte inferior. Se usan para ver cantidades variables de líquidos, y por ello están graduadas con pequeñas subdivisiones (dependiendo del volumen, de décimas de mililitro o menos). Su uso principal se da en volumetrías, debido a la necesidad de medir con precisión volúmenes de líquido variables.
      • Vaso químico: Material de laboratorio de vidrio, que se utiliza como recipiente y también para obtener precipitados.
      • Gotero: es un tubo hueco terminado en su parte inferior en forma cónica y cerrado por la parte superior por una perilla o dedal de goma. Se utiliza para trasvasar pequeñas cantidades de líquido vertiéndolo gota a gota.
      • Pipetas: La pipeta es un instrumento volumétrico de laboratorio que permite medir la alícuota de líquido con bastante precisión. Suelen ser de vidrio. Está formada por un tubo transparente que termina en una de sus puntas de forma cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas) indicando distintos volúmenes.
      • Erlenmeyer: El matraz o frasco de Erlenmeyer es un frasco transparente de forma cónica con una abertura en el extremo angosto, generalmente prolongado con un cuello cilíndrico, que suele incluir algunas marcas. Por su forma es útil para realizar mezclas por agitación y para la evaporación controlada de líquidos; además, su abertura estrecha permite la utilización de tapones.
      • Gaza: Una gasa es una malla, con más o menos hilos (lo cual determina la calidad del resultado final del impreso). Existen mallas para este proceso de muchos tipos y diferentes hilos usados. La gasa de algodón ha sido tradicionalmente usada en compresas y vendas para cubrir y proteger heridas sin impedir el contacto con el aire.
      •  
      • Embudo Buchner: Un embudo Büchner es una pieza del material de laboratorio de química utilizado para realizar filtraciones. Tradicionalmente se produce en porcelana, por lo que se lo clasifica entre el material de porcelana. Pero también hay disponibles en vidrio y plástico, a causa de su bajo costo y menor fragilidad, utilizados principalmente en escuelas secundarias.
      • Licuadora: un electrodoméstico con un motor eléctrico que hace girar unas cuchillas que muelen los alimentos.
      • Espectrofotómetro Visible: Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
      Reactivos

      toxc2.jpgtoxc3.jpg

      Procedimiento:





      SOLUCIONES/TUBO
      1
      2
      3
      4
      5
      6
      Estudio de la actividad enzimática sin inhibidor
      mL Amortiguador pH 6
      4
      4
      4
      4
      4
      4
      mL Agua destilada
      9
      7
      5
      3
      1
      11
      mL de Pirogalol 1%
      2
      4
      6
      8
      10
      -
      Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm.  Proceder con un tubo a la vez y añadir la enzima.
      mL Enzima
      0.5
      0.5
      0.5
      0.5
      0.5
      0.5
      Estudio de inhibición con ác. Benzoico 0.02%
      mL Amortiguador pH 6
      4
      4
      4
      4
      4

      mL Agua destilada
      8
      6
      4
      2
      0

      ml de Pirogalol 1%
      2
      4
      6
      8
      10

      ml de ác. Benzoico 0.02%
      1
      1
      1
      1
      1

      Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm. Proceder con un tubo a la vez y añadir 2ml de enzima
      Actividades:

      1. Construya un gráfico de actividad (Unidades de Absorbancia por segundo) versus Concentración de Pirogalol.
      2. Graficar también 1/act.Vs 1[S] y calcular la Km de la fenolasa.
      3. Construya un gráfico de actividad (Unidades de Absorbancia por segundo) versus Concentración de Pirogalol. Con inhibidor.
      4. Graficar también 1/act. Vs [S] y calcular la Km aparente, el tipo de inhibición y la K del ácido benzoico.